Резюме: Ученые впервые зафиксировали молекулярный механизм работы белка TRPM8, отвечающего за ощущение холода и ментоловой прохлады в наших нервных клетках. Исследование с использованием криоэлектронной микроскопии (cryo-EM) и масс-спектрометрии с водородно-дейтериевым обменом (HDX-MS) показало, как этот белок меняет свою форму.
Выяснилось, что при низких температурах в белке TRPM8 стабилизируется определенная область, позволяя молекуле липида встроиться, подобно защелке, и удерживать «ворота холода» открытыми для передачи сигнала в мозг. Это открытие объясняет низкую чувствительность птиц к холоду по сравнению с людьми и открывает перспективы для новых методов лечения хронической боли, вызываемой холодом.
Ключевые факты
- Порог активации 26°C: Белок TRPM8 начинает менять форму и «открывать» свои ворота только при температуре ниже примерно 26°C (79°F).
- Механизм «липидного замка»: В отличие от многих белков, работающих самостоятельно, TRPM8 требует, чтобы соседняя молекула липида (жира) встроилась в открывшуюся щель, удерживая канал открытым и поддерживая сигнал холода.
- Птицы против млекопитающих: Сравнение TRPM8 человека и птиц позволило выявить точные молекулярные «шарниры», делающие млекопитающих значительно более чувствительными к холоду окружающей среды, чем птиц.
- Технологический прорыв: Это значительное достижение для структурной биологии; исследователи смогли визуализировать белок, когда он еще находился в своей нативной клеточной мембране, что предотвратило его разрушение, обычно происходящее в лабораторных условиях.
Когда вы опускаете руку в ведро со льдом, выходите на улицу в морозный день или чувствуете прохладу ментоловой зубной пасты, белок TRPM8 в ваших нервных клетках активируется, открываясь как крошечные ворота для передачи сигнала «холода» в ваш мозг.
Ученые из Калифорнийского университета в Сан-Франциско (UCSF) теперь раскрыли, как TRPM8 меняет свою форму при воздействии низких температур.
Эта работа, опубликованная 25 марта в журнале Nature, может однажды быть использована для лечения боли, вызванной холодом, а также объясняет, почему птицы, обладающие TRPM8, гораздо менее чувствительны к холоду, чем млекопитающие.
«Всегда было интересно понять, как работает термочувствительность, но это оказалось технически сложной задачей, — сказал соавтор Дэвид Джулиус, доктор философии, лауреат Нобелевской премии по физиологии или медицине 2021 года за открытие TRPV1, отвечающего за ощущение остроты перца чили. — Получить такое понимание — это очень волнующе».
Ключом к открытию стало наблюдение за движением белков. «Десятилетиями структурная биология концентрировалась на фиксации белков в стабильных, замороженных состояниях. Эта работа демонстрирует, что для истинного понимания функции белка необходимо также понимать, как он движется», — добавил Йифан Ченг, доктор философии, профессор биохимии и биофизики, соруководитель исследования.
Упрямый белок
Ученым было известно, что TRPM8 активируется при температурах ниже 26°C (79°F) и отвечает как за ощущение холода, так и за ментоловую прохладу. Однако, несмотря на многолетние усилия, не удавалось зафиксировать его точную молекулярную структуру в момент реакции на холод. TRPM8 обычно находится во внешней мембране нервных клеток и имеет тенденцию распадаться при изоляции. Большинство методов визуализации требуют, чтобы белки находились в единой, стабильной структуре, что ограничивало возможность наблюдать динамичные промежуточные формы в процессе изменения их конфигурации.
Команды Джулиуса и Ченга решили эту проблему, визуализируя TRPM8, пока он оставался встроенным в мембраны, полученные непосредственно из клеток. «Мы поняли, что белок особенно чувствителен к обращению с ним. Сохранение его в нативной мембране наконец позволило нам увидеть, что на самом деле происходит», — отметил Кевин Чой, аспирант UCSF и один из первых авторов исследования.
Картирование влияния холода
Чтобы зафиксировать процесс открытия TRPM8, команда использовала две взаимодополняющие методики: криоэлектронную микроскопию (cryo-EM), позволяющую получать статичные изображения, и масс-спектрометрию с водородно-дейтериевым обменом (HDX-MS), которая более динамична. Для cryo-EM образцы белка подготавливали в условиях холода, с ментолом или при комнатной температуре, а затем мгновенно замораживали. Это фиксировало канал в его текущей конфигурации, позволяя cryo-EM создавать трехмерные «снимки» атомарного строения белка. HDX-MS использовалась для отслеживания белка в реальном времени при изменении температуры окружающей среды, выявляя области молекулы, которые изгибаются и перемещаются. Совместное применение этих методов позволило исследователям точно смоделировать, как TRPM8 открывается при температуре ниже 26°C (79°F).
«Как фотография лошади не может рассказать, насколько быстро она бежит, так и одна лишь электронная микроскопия не может показать, как движется молекула и что движет этими движениями, — объяснила Сяосюань Линь, один из первых авторов, научный сотрудник HHMI в лаборатории Ченга в UCSF. — Но сочетание этих двух методов дало нам представление о происходящем».
Анализ показал, что холод стабилизирует определенную область канала TRPM8, что, в свою очередь, вызывает движение ключевой спирали. Это позволяет отдельной молекуле липида встроиться в это место, фиксируя канал в открытом состоянии и поддерживая сигнал холода. Сравнивая человеческий TRPM8 с его птичьим аналогом, который реагирует на ментол, но гораздо менее чувствителен к холоду, исследователи смогли выявить особенности, отвечающие именно за обнаружение холода.
Урок для структурной биологии
Эта новая работа открывает путь для определения структуры других динамичных белков, которые обычно трудно визуализировать. «Уроки, извлеченные при изучении этого канала, очень полезны в более широком смысле, — сказал Ченг. — Динамическое поведение критически важно для функции многих белков, и его невозможно понять по одному статичному изображению структуры белка». Джулиус и Ченг теперь применяют ту же стратегию для лучшего понимания TRPV1, канала, реагирующего на тепло, который Джулиус открыл в 1997 году. Они также планируют изучить, как соединения, блокирующие TRPM8 (некоторые из которых находятся на стадии клинических испытаний для лечения боли), влияют на структуру белка. Это может в конечном итоге способствовать созданию более целенаправленных методов лечения таких состояний, как холодовая аллодиния, при которой даже легкий холод вызывает сильную боль.
Ответы на ключевые вопросы:
О: Ментол — это «молекулярный имитатор». Он связывается с белком TRPM8 и обманывает его, заставляя изменить форму точно так же, как это делает холодный ветерок. Ваш мозг получает сигнал «холода», потому что «ворота» открыты, независимо от фактической температуры.
О: Они использовали крио-ЭМ для получения тысяч высокоскоростных «снимков» и HDX-MS для отслеживания изменения веса белка при его изгибании. Сочетание этих методов похоже на превращение серии фотографий в высококачественный фильм о бегущей лошади.
О: Безусловно. Некоторые люди страдают от холодовой аллодинии, когда даже легкий ветерок ощущается как жгучий укол льда. Точно понимая, как «запираются» ворота TRPM8, ученые могут разработать лекарства, которые будут «блокировать» этот замок и предотвращать попадание болевого сигнала в мозг.
Аннотация
Структурная энергетика холодовой чувствительности
Термочувствительные ионные каналы транзиторного рецепторного потенциала (TRP) позволяют соматосенсорным нервным волокнам обнаруживать изменения в нашей тепловой среде в широком физиологическом диапазоне. У млекопитающих рецептор ментола TRPM8 активируется при температурах ниже примерно 26 °C и необходим для восприятия холода или химических охлаждающих агентов.
Захватывающей, но до сих пор недостигнутой целью является выяснение механизмов, как структурных, так и термодинамических, с помощью которых TRPM8 или другие термочувствительные каналы управляются изменениями температуры окружающей среды.
Недавние исследования с использованием криогенной электронной микроскопии пытались решить эту сложную проблему, но они были ограничены трудностями в визуализации конформационных подсостояний, вызванных температурой, или в оценке энергетического ландшафта, управляющего переходами затвора.
В данной работе мы устраняем этот пробел, комбинируя криогенную электронную микроскопию с масс-спектрометрией водородно-дейтериевого обмена для выяснения механизма активации TRPM8, вызванной холодом.
Во-первых, мы визуализировали каналы TRPM8 в клеточных мембранах, где были зафиксированы подлинные открытые состояния, вызванные ментолом и холодом. Мы также идентифицировали новую «полу-переставленную» архитектуру, в которой интердигитация субъединиц канала существенно изменяется после перемещения трансмембранной спирали S6 и элементов области поры.
Затем мы использовали масс-спектрометрию водородно-дейтериевого обмена для точного определения областей поры и TRP-спиралей как областей, демонстрирующих наибольшие изменения энергии, вызванные стимулом, которые управляют затвором канала. В частности, вызванная холодом стабилизация внешней области поры перемещает трансмембранную спираль S6, выстилающую пору, одновременно позволяя связывание регуляторного липида для стабилизации открытого канала.
Структурные механизмы, связанные с активацией, подтверждены сравнением человеческого TRPM8 с ментол-чувствительным, но относительно холодно-нечувствительным птичьим ортологом.
Мы предлагаем ландшафт свободной энергии и конформационный путь, посредством которого холод или охлаждающие агенты активируют этот термосенсорный рецептор.
